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DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3B(DNMT3B)真核蛋白操作步驟

日期:2023-07-12瀏覽:427次

DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3B(DNMT3B)真核蛋白操作步驟:


Ⅰ 實體組織蛋白的提取


1. 在每1mL 冷Lysis Buffer加入10 μL磷酸酶抑制劑, 1 μL蛋白酶抑制劑和 5μL 100mM PMSF,混勻。冰上保存數(shù)分鐘待用。


2.  每100mg固體組織置于培養(yǎng)皿中,剪碎成3mm×3mm左右的小塊,加入0.5~1 mL冷 Lysis Buffer,玻璃勻漿器上下手動勻漿15次,注意低溫操作;


3. 取組織勻漿液轉(zhuǎn)移到1.5mL預(yù)冷的離心管,離心10000轉(zhuǎn)/分,4℃離心5 min;


4. 取上清轉(zhuǎn)移至新的預(yù)冷的離心管中,即為全蛋白提取物,蛋白定量(Bradford法、BCA法);


5. 分裝保存于-70℃,避免反復(fù)凍融。


Ⅱ 培養(yǎng)細胞蛋白提取


1. 貼壁培養(yǎng)的細胞,吸去培養(yǎng)基后,加入10mL/150mm培養(yǎng)板的冷PBS洗兩次,每次振搖數(shù)次以盡量去除培養(yǎng)液;


2. 懸浮培養(yǎng)的細胞或用細胞刮子刮下的貼壁細胞,將細胞及培養(yǎng)液移至離心管中, 1000轉(zhuǎn)/分離心10 min,再用10mL/150mm培養(yǎng)板的冷PBS,1000轉(zhuǎn)/分離心5 min洗兩次;


3. 在每 1mL冷 Lysis Buffer加入10μL磷酸酶抑制劑, 1μL蛋白酶抑制劑和5μL 100mM PMSF,混勻。冰上保存數(shù)分鐘待用。


4. 細胞洗滌后,轉(zhuǎn)至新的預(yù)冷的離心管中,加入上述配制好的冷Lysis Buffer,加入量如下表所示:


細胞數(shù)量


Lysis Buffer加入量


107個


0.5 mL~1 mL


5×106個


0.2 mL~0.5 mL


5.置于4℃搖床平臺上,溫和振蕩15 min;


6. 14,000rpm,4℃離心15min,取上清為全蛋白提取物, 蛋白定量(Bradford法、BCA法);


7. 分裝保存于-70℃,避免反復(fù)凍融

DNA堿性膠上樣液(1.5 mL)

DNA堿性膠上樣液(10 mL)

DNA尿素-PAGE上樣液(1.5 mL)

DNA尿素-PAGE上樣液(10 mL)

DNA上樣液(紅),6×(非甘油)(見關(guān)聯(lián)產(chǎn)品)

DNA上樣液(藍),6×(非甘油)(見關(guān)聯(lián)產(chǎn)品)

DNA上樣液,6×(紅)

DNA上樣液,6×(藍)

miRNA尿素-PAGE上樣液(1.5 mL)

miRNA尿素-PAGE上樣液(10 mL)

三合一RNA上樣液(A型)

三合一RNA上樣液(B型)

核酸染料

SYBR Green Ⅱ核酸染料

超快核酸銀染試劑盒

電泳級SYBR Green I

電泳級耐熱型SYBR染料

綠如藍核酸染料(UV)(0.5 mL)

綠如藍核酸染料(UV)(1.5 mL)

綠如藍核酸染料(可見光型)

溴化乙錠干粉

溴化乙錠清除劑(EB清除劑)

溴化乙錠溶液(1.5 mL)


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