PCR檢測試劑盒引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵,PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其設(shè)計互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物,利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。
PCR檢測試劑盒采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)檢測,可用于檢測各種待檢標(biāo)本(如血液、糞便、食物、生物材料等)中所感染的特定細(xì)菌或病毒的某一特定基因,進(jìn)而確定該細(xì)菌或病毒的感染/污染狀態(tài)。試劑盒中所含引物能特異性擴(kuò)增該細(xì)菌或者病毒的保守區(qū)域,不會交叉擴(kuò)增細(xì)胞基因組。與傳統(tǒng)的選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)檢測方法和免疫血清學(xué)檢測方法相比較,本方法更為快速,特異性更高。
1、樣品準(zhǔn)備
組織樣本處理:在無菌條件下,將組織樣本剪碎,加入裂解液進(jìn)行勻漿處理,以充分釋放核酸。
血液樣本處理:對于血液樣本,可能需要先進(jìn)行紅細(xì)胞裂解,然后從白細(xì)胞中提取核酸。
2、核酸提取
裂解與結(jié)合:使用特定的裂解液和結(jié)合緩沖液,使細(xì)胞膜破裂并釋放出核酸,然后通過離心或磁珠技術(shù)捕獲核酸。
洗滌與洗脫:通過一系列洗滌步驟去除蛋白質(zhì)和其他污染物,最后用洗脫液將核酸從固相支持物上洗脫下來。
3、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA:如果目標(biāo)是檢測RNA病毒,需要先進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),將RNA模板轉(zhuǎn)錄成cDNA。
4、PCR擴(kuò)增
配制反應(yīng)體系:根據(jù)試劑盒說明,將模板DNA、引物、dNTPs、聚合酶等組分混合在PCR管中。
設(shè)定擴(kuò)增條件:將PCR管放入熱循環(huán)儀中,設(shè)置適當(dāng)?shù)淖冃?、退火和延伸溫度及時間,進(jìn)行多次循環(huán)以擴(kuò)增目標(biāo)序列。
5、結(jié)果分析
電泳檢測:擴(kuò)增后的產(chǎn)物通常需要通過瓊脂糖凝膠電泳來分離和檢測,觀察是否有預(yù)期大小的條帶出現(xiàn)。
數(shù)據(jù)分析:根據(jù)電泳結(jié)果或?qū)崟r熒光定量PCR的數(shù)據(jù),對樣本中的核酸含量進(jìn)行分析和解釋。