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更新時(shí)間:2024-09-12
探針?lè)晒舛縋CR試劑盒原理是由一對(duì)引物介導(dǎo),能在動(dòng)植物體外對(duì)特定基因(DNA)片斷進(jìn)行快速酶促擴(kuò)增,經(jīng)過(guò)n個(gè)熱循環(huán)擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物中所含特定基因數(shù)是原始模板數(shù)的(1+E)n(0<E<1,擴(kuò)增效率=倍,使得檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物中的特定基因成為可能。
特異性強(qiáng)
?PCR反應(yīng)的特異性決定因素為:
①引物與模板DNA特異正確的結(jié)合;
②堿基配對(duì)原則;
③Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性;
④靶基因的特異性與保守性。
適用范圍【參考值】
1.試劑盒有效性判定:
(1)陽(yáng)性對(duì)照:有典型S型擴(kuò)增曲線或Ct值≤35。
(2)陰性對(duì)照:Ct值>38或無(wú)Ct值,線形為直線或輕微斜線,無(wú)指數(shù)增長(zhǎng)期。
2.標(biāo)本結(jié)果判定:
(1)陽(yáng)性:標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期。
(2)可疑:標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果Ct值在35~38范圍內(nèi)。此時(shí)應(yīng)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)檢測(cè),如重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Ct值仍在35~38范圍內(nèi),有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期,則判定為陽(yáng)性,否則為陰性。
(3)陰性:標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果Ct值>38或無(wú)Ct值。
PCR實(shí)驗(yàn)步驟:
典型的PCR由(1)高溫變性模板;(2)引物與模板退火;(3)引物沿模板延伸三步反應(yīng)組成一個(gè)循環(huán),通過(guò)多次循環(huán)反應(yīng),使目的DNA得以迅速擴(kuò)增。
其主要步驟是:
將待擴(kuò)增的模板DNA置高溫下(通常為93℃-94℃)使其變性解成單鏈;
人工合成的兩個(gè)寡核苷酸引物在其合適的復(fù)性溫度下分別與目的基因兩側(cè)的兩條單鏈互補(bǔ)結(jié)合,兩個(gè)引物在模板上結(jié)合的位置決定了擴(kuò)增片段的長(zhǎng)短;
耐熱的DNA聚合酶(Taq酶)在72℃將單核苷酸從引物的3’端開(kāi)始摻入,以目的基因?yàn)槟0鍙?’→3’方向延伸,合成DNA的新互補(bǔ)鏈。
實(shí)驗(yàn)過(guò)程:
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2.對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物(在PCR反應(yīng)中,新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制,而不能從無(wú)到有,憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物??梢允荄NA也可以是RNA,一般20多bp,需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此,擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物)
3.10×PCR Buffer
4.2mM dNTPmix:含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5.Taq酶
二、操作步驟
1.在冰浴中,按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o(wú)菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer 5μl
dNTP mixl 4μl
引物1(10pM) 2μl
引物2(10PM) 2μ
Taq酶(2U/μl) 1μl
DNA模板(50ng-1μg/μl) 1 μl
加ddH2O至 50 μl
視PCR儀有無(wú)熱蓋,不加或添加石蠟油。
2.調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心,立即置PCR儀上,執(zhí)行擴(kuò)增。一般:在93℃預(yù)變性3-5min,進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段:93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,循環(huán)30-35次,后在72℃ 保溫7min。
3.結(jié)束反應(yīng),PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。
4.PCR的電泳檢測(cè):如在反應(yīng)管中加有石蠟油,需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液,以除去石蠟油;否則,直接取5-10μl電泳檢測(cè)
三、注意事項(xiàng)
1.PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒(méi)有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。好設(shè)立一個(gè)的PCR實(shí)驗(yàn)室。
2.純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有影響。一般而言,只要能夠得到可靠的結(jié)果,純化的方法越簡(jiǎn)單越好。
3.所有試劑都應(yīng)該沒(méi)有核酸和核酸酶的污染。操作過(guò)程中均應(yīng)戴手套。
下列是公司正在熱銷的產(chǎn)品:
XAF1 antibody原裝、分裝型肝炎病毒核心蛋白(19-25)
Aquaporin 4 antibody原裝、分裝型肝炎病毒核心蛋白(59-68)
C2orf68 antibody原裝、分裝型肝炎病毒核心蛋白(107-114)
TRAAK antibody原裝、分裝型肝炎病毒4A區(qū)蛋白(21-34)(JT菌株)
Native Streptavidin protein (10nm Gold)原裝、分裝型肝炎病毒4A區(qū)蛋白(22-33)(FAD菌株)
Sumo 2 + Sumo 3 antibody [8A2] - ChIP Grade原裝、分裝型肝炎病毒非結(jié)構(gòu)4A蛋白(22-34)(H菌株)
Native Streptavidin protein (15nm Gold)原裝、分裝型肝炎病毒核蛋白(88-96)
Native Streptavidin protein (20nm Gold)原裝、分裝型肝炎病毒-1 e2蛋白(484-499)
Recombinant Human PSMA7/HSPC protein原裝、分裝型肝炎病毒-1 e2蛋白(554-569)MMP26 antibody [EP1283Y]原裝、分裝生長(zhǎng)激素釋放子,大鼠
MMP8 antibody [EP1252Y]原裝、分裝生長(zhǎng)激素釋放子(1-44),人
MMP8 antibody [EP1252Y]原裝、分裝生長(zhǎng)激素釋放子-2
MMP8 antibody [EP1252Y]原裝、分裝腸抑胃肽,,大鼠
Nodal antibody [EP2058Y]原裝、分裝腸抑胃肽,豬
Nodal antibody [EP2058Y]原裝、分裝腸抑胃肽(1-30)酰胺,豬
Nodal antibody [EP2058Y]原裝、分裝腸抑胃肽(3-42),人
CD34 antibody [EP373Y]原裝、分裝α-醇溶蛋白(43-49)
CD34 antibody [EP373Y]原裝、分裝胰高血糖素樣肽-1(1-37),人,牛,大鼠,小鼠,荷蘭豬
探針?lè)晒舛縋CR試劑盒基質(zhì)金屬蛋白酶14檢測(cè)試盒20mg
基質(zhì)金屬蛋白酶1酶原檢測(cè)試盒20mg
基質(zhì)金屬蛋白酶2/明膠酶A檢測(cè)試盒20mg
基質(zhì)金屬蛋白酶25檢測(cè)試盒20mg
基質(zhì)金屬蛋白酶3/基質(zhì)裂解素1檢測(cè)試盒20mg
基質(zhì)金屬蛋白酶4檢測(cè)試盒20mg
基質(zhì)金屬蛋白酶5檢測(cè)試盒20mg
基質(zhì)金屬蛋白酶7檢測(cè)試盒20mg
基質(zhì)金屬蛋白酶8/中性粒細(xì)胞膠原酶檢測(cè)試盒20mg